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Chom化疗插件及bug修复
目前肿瘤多个实验策略分布： - （化疗、乳腺癌2基因、肺癌Can28、个体化用药50基因Chp2、中创100位点均是采用多重PCR进行扩增测序；AIO为捕获测序） - （化疗、乳腺癌2基因、中创100位点均为germline，仅肺癌Can28、个体化用药50基因Chp2以及AIO panel为体细胞突变） 化疗插件，是用TVC检测的变异。 1、分析流程 （1）通过脚本bin/get_chmo_bam.pl遍历basecaller_results目录下的bam文件，判断bam文件中的SM信息中是否包含chmo(不区分大小写），并链接到rawdata目录中； （2）运行主程序 ``` ## perl ${PLUGIN_PATH}/chmo_pipeline.pl ${ANALYSIS_DIR} ${RESULTS_DIR} ${reference} ${PLUGIN_PATH}/data/amplican.bed ${PLUGIN_PATH}/data/target.bed perl /results/plugins/Chom/chmo_pipeline.pl /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271 /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629 /results/referenceLibrary/tmap-f3/hg19/hg19.fasta /results/plugins/Chom/data/amplican.bed /results/plugins/Chom/data/target.bed ``` 生成total.sh，包括每个样本的shell命令。如：sh /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.sh； - 扩增子文件amplican.bed（共13个）： ``` chr1 20915650 20915789 Came_01 chr1 20931409 20931528 Came_02 chr1 97915564 97915681 Came_03 chr1 11856334 11856473 Came_04 chr2 234668802 234668928 Came_05 chr7 87138600 87138720 Came_06 chr7 87160520 87160659 Came_07 chr11 67352640 67352771 Came_08 chr15 51502793 51502926 Came_09 chr19 44055682 44055818 Came_10 chr19 44057511 44057633 Came_11 chr19 45923609 45923742 Came_12 chr22 42526642 42526766 Came_13 ``` 对应的目标捕获区间文件target.bed文件 ``` chr1 20915671 20915766 Came_01 chr1 20931432 20931505 Came_02 chr1 97915587 97915658 Came_03 chr1 11856357 11856450 Came_04 chr2 234668825 234668908 Came_05 chr7 87138623 87138697 Came_06 chr7 87160543 87160638 Came_07 chr11 67352661 67352748 Came_08 chr15 51502816 51502903 Came_09 chr19 44055703 44055797 Came_10 chr19 44057534 44057611 Came_11 chr19 45923631 45923719 Came_12 chr22 42526662 42526746 Came_13 ``` （3）每个样本的shell具体过程 ``` # step1, easy_trim.pl对下机的bam文件进行修剪。筛选出序列长度高于50的reads,对其末端20bp进行修剪，并输出到Tag167.clean.bam文件中，并统计clean_rate到Tag167/Tag167.clean.stat中。 perl /results/plugins/Chom/bin/easy_trim.pl /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/rawdata/Tag167_rawlib.basecaller.bam /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.clean > /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.clean.stat # step2，比对，sort /results/plugins/Chom/tools/tmap mapall -n 12 -g 3 -a 0 -i bam -o 2 -f /results/referenceLibrary/tmap-f3/hg19/hg19.fasta -r /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.clean.bam -v -Y -u --prefix-exclude 5 stage1 map4 > /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.mapped.bam && rm /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.clean.bam /results/plugins/Chom/tools/samtools sort /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.mapped.bam /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.mapped.sorted && rm /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.mapped.bam # step3, 统计Q17和Q20并过滤。 判断read的Q20比例超过该read长度的50%，则保留，并用于统计过滤后的Q17和Q20比例。如Q20比例低于60%，给出WARNING； perl /results/plugins/Chom/bin/get_sm_q20.pl /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.mapped.sorted.bam /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629 Tag167 > /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.q20.stat # step4, 过滤reads长度低于30的，并统计target区覆盖度，ontarget率等等。生成Tag167.fixed.bam，建index，统计各位点depth，以及扩增子平均深度。对于ontarget率低于0.7的在Tag167.stat文件末尾给出WARNING。 perl /results/plugins/Chom/bin/bam_qc.pl /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.qual.bam Tag167 /results/plugins/Chom/data/amplican.bed /results/plugins/Chom/data/target.bed /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167 /results/plugins/Chom/tools/samtools index /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.fixed.bam perl /results/plugins/Chom/bin/bam_depth2.pl /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.fixed.bam > /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.stb.depth perl /results/plugins/Chom/bin/amp_depth.pl /results/plugins/Chom/data/target.bed /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.stb.depth > /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.stb # step5, TVC变异检测； python /results/plugins/Chom/tools/variantCaller/variant_caller_pipeline.py -i /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.fixed.bam -o /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant -B /results/plugins/Chom/tools/variantCaller -n 10 -r /results/referenceLibrary/tmap-f3/hg19/hg19.fasta -b /results/plugins/Chom/data/target.bed -p /results/plugins/Chom/data/targetseq_germline_lowstringency_p1_parameters.json -s /results/plugins/Chom/data/100.hotspot.vcf # step6, split多等位基因位点并校正TVC检测的位点（注意：最后参数指定的mppana.txt在该步骤未用上的）； perl /results/plugins/Chom/bin/splitVcfMuliAlt.pl /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant/TSVC_variants.vcf /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant/TSVC_variants.split.vcf /results/plugins/Chom/data/100.hotspot.vcf /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant/Tag167.mppana.txt # step7, mpileup分析； /results/plugins/Chom/tools/samtools mpileup -BQ0 -d 100000 -f /results/referenceLibrary/tmap-f3/hg19/hg19.fasta -l /results/plugins/Chom/data/target.bed /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167.fixed.bam > /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant/Tag167.pileup perl /results/plugins/Chom/bin/mpileupAnalysis.pl /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant/Tag167.pileup /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant/Tag167.mppana.txt # step8, 提取变异信息 #perl /results/plugins/Chom/bin/extractInfoTvcVcf.pl /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant/TSVC_variants.split.vcf /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant/Tag167.allvar.txt perl $Bin/bin/extractInfoTvcVcf_new.pl $out_dir/$sample_name/$variant/TSVC_variants.split.vcf $out_dir/$sample_name/$variant/$sample_name.mppana.txt $out_dir/$sample_name/$variant/$sample_name.allvar.txt rm /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/*.sam # step9, 关联到用药字典dictionary.txt（同时对chr7:87160618:ABCB1:c.2677T>A/G和chr2:234668879:UGT1A1:c.-52TA[7]做处理）。该步对这两个位点修改bug，用程序chemo_new.pl。 #perl /results/plugins/Chom/bin/chemo.pl /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant/Tag167.allvar.txt /results/plugins/Chom/data/dictionary.txt /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant perl /results/plugins/Chom/bin/chemo_new.pl /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant/Tag167.allvar.txt /results/plugins/Chom/data/dictionary.txt /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant # step10，结果上传到报告系统 perl /results/plugins/Chom/bin/uploadResult.pl /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant/chemo_simple.txt /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant/chemo_output.txt CHMO-LCM-20180920-167 /results/analysis/output/Home/Auto_user_2456177-5-0049-125-P5-HiQ-pooling-P5-Can28-BRCA-CHMO-20180920_264_271/plugin_out/Chom_out.629/Tag167/Tag167variant ``` 2、bug1: 完善过滤条件：耳聋100位点也是多重PCR测序的，判断了是否每个hotspot均在TSVC_variants.vcf文件中是否存在，如果不存在，判断该位点的深度是否>=30X，如果为真，则基于频率进行判断。 （1）下面为hotspot文件，/results/plugins/Chom/data/100.hotspot.vcf ``` ##fileformat=VCFv4.1 ##allowBlockSubstitutions=true #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO chr1 11856378 . G A . . OID=MTHFR:c.665C>T;OPOS=11856378;OREF=G;OALT=A;OMAPALT=A chr1 20915701 . A C . . OID=CDA:c.79A>C;OPOS=20915701;OREF=A;OALT=C;OMAPALT=C chr1 20931474 . G A . . OID=CDA:c.208G>A;OPOS=20931474;OREF=G;OALT=A;OMAPALT=A chr1 97915614 . C T . . OID=DPYD:c.1905+1G>A;OPOS=97915614;OREF=C;OALT=T;OMAPALT=T chr2 234668879 . C CAT . . OID=UGT1A1:c.-52TA[7];OPOS=234668879;OREF=C;OALT=CAT;OMAPALT=CAT chr2 234668880 . ATATATATATAT ATATATATATATAT,ATATATATATATATAT . . OID=UGT1A1:c.-52TA[7],UGT1A1:c.-52TA[8];OPOS=234668881,234668881;OREF=TATATATATATA,TATATATATATA;OALT=TATATATATATATA,TATATATATATATATA;OMAPALT=ATATATATATATAT,ATATATATATATATAT chr7 87138645 . A G . . OID=ABCB1:c.3435T>C;OPOS=87138645;OREF=A;OALT=G;OMAPALT=G chr7 87160618 . A C,T . . OID=ABCB1:c.2677T>G,ABCB1:c.2677T>A;OPOS=87160618,87160618;OREF=A,A;OALT=C,T;OMAPALT=C,T chr11 67352689 . A G . . OID=GSTP1:c.313A>G;OPOS=67352689;OREF=A;OALT=G;OMAPALT=G chr15 51502844 . A C . . OID=CYP19A1:c.*161T>G;OPOS=51502844;OREF=A;OALT=C;OMAPALT=C chr19 44055726 . T C . . OID=XRCC1:c.1196A>G;OPOS=44055726;OREF=T;OALT=C;OMAPALT=C chr19 44057574 . G A . . OID=XRCC1:c.580C>T;OPOS=44057574;OREF=G;OALT=A;OMAPALT=A chr19 45923653 . A G . . OID=ERCC1:c.354T>C;OPOS=45923653;OREF=A;OALT=G;OMAPALT=G chr22 42526694 . G A . . OID=CYP2D6:c.100C>T;OPOS=42526694;OREF=G;OALT=A;OMAPALT=A ``` （2）hotspot文件共有14个行，共13位点，经过对433个样本的TSVC_variants.vcf文件检查， ``` ls Auto*/result/*/result/Tag*/*variant/TSVC_variants.vcf|wc -l #总样本数 for i in `cat /results/plugins/Chom/data/100.hotspot.vcf|grep -v '^#' |awk '{split($8,x,/;/);split(x[1],y,/=/);print y[2]}'`;do echo -e $i" \c";grep $i Auto*/result/Tag*/*variant/TSVC_variants.vcf|wc -l;done #每个位点样本覆盖情况 grep 'UGT1A1:c.-52TA' Auto*/result/*/result/Tag*/*variant/TSVC_variants.vcf|wc -l #'UGT1A1:c.-52TA'位点按该语句统计； ``` 其中UGT1A1:c.-52TA有324个，XRCC1:c.1196A>G只有117个，ERCC1:c.354T>C有432个，CYP2D6:c.100C>T共有357个；其余位点均有433个。 修复：不过在TSVC_variants.split.vcf文件中已经修复（即脚本/results/plugins/Chom/bin/splitVcfMuliAlt.pl）。 bug2: 化疗结果发现一个现象：rs2032582这一个位点，二代结果给出AT、AC两个结果，sanger结果为CT；查后台结果该突变检测无误；所以我们考虑应该是这个点在基因型判断的法则上写的有问题，导致显示到前端的结果异常。请抽空帮忙修正下该异常，最好这周可以修正（一方面报给患者一直错不好，一方面马上转检验），可以跟建文讨论   该位点错误示例样本：CHMO-YXS-20180831-140，在RunID： /results/analysis/output/Home/Auto_sn247560054_sn247560054-855-P30-HiQ-Pooling-Can28_CHMO_BRCA-PGX-180831_236_179/plugin_out/Chom_out.484/Tag140/Tag140variant 修复：经过对13个样本一代验证，其中12个二代同时检出该位点为AC、AT两种杂合，一代验证结果为CT，对应的mpileup分析结果中频率也是C和T高（CT之和超过0.98，且ref上A的频率低于0.02），另一个样本二代检出为AC，无AT突变，一代验证结果和二代一致也为AC杂合突变。对这个位点修改bug，用程序chemo_new.pl。是在原程序chemo.pl中加入对chr7:87160618-AC和chr7:87160618-AT的判断，如果都存在，则修改为chr7:87160618-CT输出结果，而不再是AC和AT均输出。 bug2: 化疗这边还有一个紧急问题需要你帮忙测试解决下：UGT1A1，c.(TA)6>（TA)5/(TA)7/(TA)8，rs8175347，这一个点会存在部分样本检测不准，如图：   在RunID： /results/analysis/output/Home/Auto_sn247560054_sn247560054-855-P30-HiQ-Pooling-Can28_CHMO_BRCA-PGX-180831_236_179/plugin_out/Chom_out.484/Tag138/Tag138variant sanger纯合和杂合图    这个问题，药物那边也存在，目前是通过重新设定基因型判断阈值来解决的，参考下按药物基因组的阈值设定，然后重分析这5个样本，看看这个重分析结果和一代结果一致性如何； 药物那边的处理方式是：  最佳解决方案： 统计好所有化疗检测的该位点（也可以加入药物那边检测的该位点），1、绘制不同基因型的频率分布图（直接设置阈值）；2、应用贝叶斯理论（同耳聋位点检测）进行基因型判定； 要用第二种方法，就需要先收集数据，汇总以前所有测的CHOM的数据，由于阳性一代验证的较少，安排阳性样本的一代验证。覆盖从低到高的频率（来自mppana.txt文件） **以下为第二种方法校正**：结果位于文件：Chom_UGT1A1-20180919.xlsx中。通过对86个样品的验证1代结果，并依据贝叶斯定理获得0-1频率范围内的各基因型的可能性。  加入脚本到流程中：chemo_new.pl和extractInfoTvcVcf_new.pl，分别替换原脚本chemo.pl和extractInfoTvcVcf.pl。 运行方式：（extractInfoTvcVcf_new.pl多加了一个mpileup的解析结果作为第二个参数） ``` perl $Bin/bin/extractInfoTvcVcf_new.pl $out_dir/$sample_name/$variant/TSVC_variants.split.vcf $out_dir/$sample_name/$variant/$sample_name.mppana.txt $out_dir/$sample_name/$variant/$sample_name.allvar.txt perl $Bin/bin/chemo_new.pl $out_dir/$sample_name/$variant/$sample_name.allvar.txt $Bin/data/dictionary.txt $out_dir/$sample_name/ $variant ``` 在第一个脚本中，对TSVC_variants.split.vcf变异结果文件中的位点chr2:234668879为C>CAT时，进行频率和基因型的校正。 |af | gt| | --- | --- | |af<=0.05 | 0/0| |0.1<af<=0.65 | 0/1| |af>=0.9 | 1/1| |others | unknow/sanger|
laihui126
2023年1月9日 14:24
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